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核酸提取的操作与运用技巧
发布日期:2022/11/8 16:30:25
对于广大的生物科研人员来说,养细胞、养细菌、提核酸等都是实验室的常见操作,实验操作费时费力,过程中可能还会遇到各种坑。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),它是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一。核酸的提取分别为DNA 提取和RNA提取,二者的提取原理大致相同,简单来说分为细胞或者组织的裂解和核酸纯化两大步骤。
核酸提取纯化方法常用的有酚/氯(lü)仿抽提法、离心柱法、磁珠法等。
1、酚/氯(lü)仿抽提法
乙(xi)烯氯(lü)仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,变性降解核蛋白,使DNA从核蛋白中游离出来。
酚/氯(lü)仿抽提法的优点是成本较低,对实验条件要求也不高。该方法的缺点也很明显:由于使用了苯(fen)酚、氯(lü)仿等有机试剂,毒性较大,长时间操作对人员健康有较大影响;而且核酸的回收率较低,损失量较大。
离心柱纯化
这里以DNA提取离心柱为例。离心柱结构主要是特殊硅基质吸附材料,能特异性吸附DNA,而RNA与蛋白质则会穿过。该方法能选择性地吸附核酸而不吸附蛋白质及盐,从而实现核酸与蛋白质及盐的分离,是目前试剂盒提取广泛使用的方法。
该方法受人为操作因素影响小,提取DNA的纯度稳定性很高;而且离心柱法提取DNA的纯度比传统酚氯(lü)仿法提取的要高。离心柱法其低廉的价格和相对便捷的操作,渐逐取代了传统DNA提取方法,被高校科研所等市场普遍接受。
该方法的缺点是需要较多的样本,对于珍稀样本则不适合采用此方法。当样品过量时,需要反复进行离心,对样品的提取效率较低,不便于高通量、自动化操作。与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入,特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域,离心柱法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。当面对突发疫情时,更是需要有高通量的DNA提取设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。
磁珠法
磁珠法是一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法,主要原理为:在不同浓度的PEG(polyethylene glycol;聚乙二醇)中,会有不同片段大小的DNA吸附在磁珠的羧基修饰层上,这些DNA可以再溶解在水中,以此来洗脱回收。
实验使用的磁珠分为五层,由内而外依次为:聚苯乙(xi)烯材料的核心、超顺磁材料(主要为四氧化三铁)、第二层聚苯乙(xi)烯材料、第二层超顺磁材料以及表面粗糙的羧基修饰层。粗糙的表面更利于核酸与羧基修饰层结合。该方法将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面,通过介质对DNA的吸附,在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动,从而达到核酸与其它物质分离的目的。
与其它集中方法相比,磁珠法具有无可比拟的优势,包括:
(1)提取灵敏度高 ,只需微量的样本就可以完成对核酸的提取;
(2)纯化的纯度高 ,磁珠与核酸的特异性结合能使核酸充分与杂质分离,使得提取的核酸纯度高、浓度大;
(3)能够实现自动化、大批量操作,通过机器自动化完成操作,所需人力少,而且同时可以完成多个样本的大批量操作。以32孔的核酸自动提取仪为例,用一个样品的提取时间即可实现对最多32个样品的处理,符合生物学高通量的操作要求,使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对。
(4)操作简单、用时短,整个提取流程只有四步,根据仪器不同,部分仪器提取时间可以缩短到30分钟,大大提高了实验效率;
(5)安全无毒,不使用传统方法中的苯、氯(lü)仿等有毒试剂,对实验操作人员的伤害减少到最少,完全符合现代环保理念;
近年来磁珠法已成为核酸提取的必备工具之一,也是核酸自动化提取设备的必备组件之一。对于实验样本量大,经常做实验的实验人员来说,自动核酸提取仪是一个不错的选择。而且对于各类核酸,不论是质粒DNA、基因组DNA,还是RNA等,一台自动核酸提取仪都可以满足实验人员的提取要求。    

目前自动核酸提取仪基本都能满足大批量核酸提取的需求,对于不同的样本(如全血、质粒、培养细胞、组织等)和核酸类型(基因组DNA,病毒DNA/RNA,质粒DNA等)等能适配,自动核酸提取仪相对传统的酚氯(lü)仿法及离心柱法要方便便捷许多。


山东博科-核酸提取仪

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